羧甲基殼聚糖席夫堿的制備及其抗菌性能研究

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申宏杰 董朝紅 呂洲 王鵬 李學(xué)超
（青島大學(xué)“纖維新材料及現(xiàn)代紡織”國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地）

　　摘要：在超聲波的作用下，以自制的低分子量羧甲基殼聚糖與香草醛為原料，制備了低分子量羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿。利用FI-IR對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，研究了香草醛與羧甲基殼聚糖中氨基的反應(yīng)摩爾比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間及超聲波功率對(duì)產(chǎn)物氨基取代度的影響。結(jié)果表明：當(dāng)香草醛與羧甲基殼聚糖中氨基的摩爾比為1:0.8，反應(yīng)時(shí)間為3h，反應(yīng)溫度為70℃，超聲波作用功率為70W時(shí)，羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿的氨基取代度可達(dá)到82.5%；將羧甲基殼聚糖席夫堿與羧甲基殼聚糖的抗菌性能進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿對(duì)金黃葡萄球菌和大腸埃希菌的抑菌圈寬度分別比羧甲基殼聚糖的抑菌圈寬0.7mm和0.5mm。
　　前言
　　羧甲基殼聚糖是一種水溶性殼聚糖衍生物，在化妝品、保鮮、醫(yī)藥、功能材料等方面有多種應(yīng)用，也是近年來研究得較多的殼聚糖衍生物之一。作為生物醫(yī)用材料，可以應(yīng)用于傷口貼、包扎帶、人造骨骼和人造皮膚以及酶的固定化載體等方面。羧甲基殼聚糖分子中含有-NH₂和-COOH，在水溶液中可以生成-NH₃⁺，因此具有抑菌殺菌功能，其中羧甲基殼聚糖對(duì)革蘭氏陽性菌的抑制效果要略好于革蘭氏陰性菌。羧甲基殼聚糖的許多獨(dú)特生理活性和功能特性與其分子量大小密切相關(guān)，低分子量的羧甲基殼聚糖的抗菌效果更優(yōu)異。席夫堿（尤其是一些芳香族的席夫堿）基團(tuán)中由于含有C=N雙鍵而使得席夫堿具有很好的抑菌、殺菌、抗腫瘤等生物活性。將殼聚糖與香草醛進(jìn)行希夫堿反應(yīng)制備的殼聚糖香草醛希夫堿，其水溶性不是很好，且反應(yīng)時(shí)間長，獲得的氨基取代度較低。
　　本文通過自制的低分子羧甲基殼聚糖與香草醛反應(yīng)，在超聲波的作用下，制備出一種低分子量羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿。該合成產(chǎn)物克服了殼聚糖席夫堿水溶性不好的缺點(diǎn)，在超聲波條件下不僅縮短了反應(yīng)時(shí)間，而且提高氨基取代度同時(shí)也提高了其抗菌性能，經(jīng)測(cè)試，其對(duì)金黃葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌性能均優(yōu)于羧甲基殼聚糖對(duì)金黃葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌性能。
　　1試驗(yàn)部分
　　1.1試驗(yàn)材料、藥品和儀器
　　14.75tex×14.75tex，524根/10cm×284根/10cm純棉漂白布（濰坊齊榮紡織印染有限公司）。
　　低分子量羧甲基殼聚糖（自制，分子量為1.0×104）；香草醛，乙醇，甲基橙，苯胺藍(lán)，氫氧化鈉，鹽酸，均為國產(chǎn)分析純；瓊脂粉，牛肉浸膏，氯化鈉，胰蛋白胨，均為生化試劑。
　　KQ2200DV型數(shù)控超聲波儀，JJ-1精密增力電動(dòng)攪拌器，DZF型真空干燥箱，索氏提取器，手提式壓力蒸汽滅菌鍋（浙江新豐醫(yī)療器械有限公司），ZSD-1160型恒溫培養(yǎng)箱，ZHWY-2102型恒溫?fù)u床，分析天平，5700型傅里葉變換紅外光譜儀（美國Nicolet公司）。
　　1.2低分子量羧甲基殼聚糖席夫堿的制備
　　稱取一定質(zhì)量的羧甲基殼聚糖放入到三口燒瓶中，加入適量的乙醇溶液，放入50℃的烘箱中使其溶脹2h。稱取一定質(zhì)量的香草醛加入到適量的乙醇溶液中使其完全溶解，然后加入到盛有已溶脹的羧甲基殼聚糖的三口燒瓶中，將三口燒瓶置于超聲波發(fā)生器中，在一定的時(shí)間、溫度和超聲波作用下進(jìn)行震蕩攪拌。將反應(yīng)完成的產(chǎn)物倒入燒杯中，靜置倒出上清液，用乙醇洗滌兩次，再用乙醇在索氏提取器中提純24h，最后將析出物放入真空干燥箱中干燥12h得到黃色固體粉末。其反應(yīng)方程式如圖1所示。

　　1.3合成產(chǎn)物的紅外表征
　　將羧甲基殼聚糖與所制備的羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿分別與溴化鉀按1:100的比例，混合均勻后，進(jìn)行壓片，用Nicolet公司5700型傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定紅外光譜圖，測(cè)定范圍400～4000cm^-1。
　　1.4測(cè)試部分
　　1.4.1羧甲基殼聚糖希夫堿氨基取代度的測(cè)定
　　取一定質(zhì)量的反應(yīng)生成物放置于100mL的錐形瓶中，加入10mL已滴定好的濃度為0.1mol/L的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液和20mL蒸餾水，靜置至完全溶解，加入2滴甲基橙溶液和4滴苯胺藍(lán)，并使用0.1mol/L的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定至剛剛出現(xiàn)黃綠色即為滴定終點(diǎn)。
　　根據(jù)氨基取代度（DS）的公式計(jì)算氨基取代度，如式（1）所示。

　　式中，DS為氨基取代度，C₁為標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液的濃度（mol/L），C₂為標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液的濃度（mol/L），V_2樣為產(chǎn)物消耗標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉的體積（L），V_2原為羧甲基殼聚糖原樣消耗標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉的體積（L），m_原為羧甲基殼聚糖的質(zhì)量（g），m_樣為產(chǎn)物的質(zhì)量（g）。
　　1.4.2羧甲基殼聚糖席夫堿抗菌性能的測(cè)試
　　根據(jù)GB/T20944.1-2007《紡織品抗菌性能的評(píng)價(jià)第1部分：瓊脂擴(kuò)散法》測(cè)定。
　　2結(jié)果與討論
　　2.1結(jié)構(gòu)表征
　　圖2為羧甲基殼聚糖與羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿的紅外光譜圖。由圖2可以看出，羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿的紅外譜圖中，1640cm^-1處為C=N的伸縮振動(dòng)峰。1532cm^-1處為苯環(huán)的特征峰，866cm^-1和830cm^-1處為苯環(huán)三取代的特征峰。1058cm^-1處為吡喃環(huán)的伸縮振動(dòng)峰，1124cm^-1處為C-O的伸縮振動(dòng)峰。與羧甲基殼聚糖紅外譜圖相比，羧甲基殼聚糖席夫堿紅外譜圖中增加了C=N基團(tuán)，1083cm^-1處的單峰變化為1124cm^-1和1058cm^-1兩個(gè)峰值。這是因?yàn)橛捎贑=N的影響使得羧甲基殼聚糖基團(tuán)中的C-O的伸縮振動(dòng)發(fā)生移動(dòng)。通過這些峰值的判斷說明羧甲基殼聚糖與香草醛發(fā)生了反應(yīng)，生成了羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿。

　　2.2反應(yīng)條件對(duì)羧甲基殼聚糖希夫堿氨基取代度的影響
　　2.2.1香草醛與羧甲基殼聚糖的摩爾比對(duì)氨基取代度的影響
　　以乙醇為溶劑，溫度為70℃，超聲波作用功率為70W，反應(yīng)時(shí)間為3h，將香草醛與羧甲基殼聚糖按不同的摩爾比進(jìn)行反應(yīng)，通過研究產(chǎn)物氨基取代度，如圖3所示。

　　從圖3可以看出，香草醛與羧甲基殼聚糖摩爾比小于1:0.8時(shí)產(chǎn)物的氨基取代度隨著香草醛與羧甲基殼聚糖的摩爾比的增加逐漸增大，當(dāng)摩爾比1:0.8之后，產(chǎn)物的氨基取代度最大，當(dāng)摩爾比超過1:0.8后，產(chǎn)物的氨基取代度隨著摩爾比的增加變化不大。因此確定香草醛與羧甲基殼聚糖的摩爾比為1:0.8。
　　2.2.2反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)物氨基取代度的影響
　　以乙醇為溶劑，香草醛與羧甲基殼聚糖的摩爾比為1:0.8，反應(yīng)溫度為70℃，超聲波功率為70W，研究不同反應(yīng)時(shí)間下對(duì)產(chǎn)物氨基取代度的影響，如圖4所示。

　　從圖4可以看出，氨基取代度在反應(yīng)時(shí)間為1.5-3h內(nèi)隨著的反應(yīng)時(shí)間的延長不斷地增加，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過3h之后，氨基取代度的變化趨于平衡。這是因?yàn)榉磻?yīng)時(shí)間小于3h時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，羧甲基殼聚糖中氨基上的N原子形成更多的孤對(duì)電子，進(jìn)攻香草醛羰基上帶正電的碳原子，使產(chǎn)物的氨基取代度不斷升高。而當(dāng)反應(yīng)超過3h后，反應(yīng)物之間的反應(yīng)達(dá)到了平衡，產(chǎn)物隨著時(shí)間的增加不會(huì)發(fā)生明顯的變化。因此合成的反應(yīng)時(shí)間確定為3h。
　　2.2.3反應(yīng)溫度對(duì)產(chǎn)物氨基取代度的影響
　　以乙醇為溶劑，香草醛與羧甲基殼聚糖的摩爾比為1:0.8，在超聲波功率為70W，反應(yīng)時(shí)間為3h的條件下，研究反應(yīng)溫度對(duì)產(chǎn)物氨基取代度的影響，如圖5所示。

　　從圖5可以看出，當(dāng)溫度低于70℃時(shí)，隨著反應(yīng)溫度的升高，產(chǎn)物的氨基取代度不斷變大。當(dāng)反應(yīng)溫度超過70℃之后，氨基取代度趨于平衡。這是因?yàn)榉磻?yīng)溫度低于70℃時(shí)，隨著反應(yīng)溫度的不斷增加，加快氨基中氮原子孤對(duì)電子的生成，使這些孤對(duì)電子更快地攻擊羰基中帶正電的碳原子，形成C=N基團(tuán)，提高了反應(yīng)速率。當(dāng)反應(yīng)溫度高于70℃之后，氨基取代度趨于達(dá)到最大值。所以確定最佳的反應(yīng)溫度為70℃。
　　2.2.4超聲波作用功率對(duì)氨基取代度的影響
　　以乙醇為溶劑，香草醛與羧甲基殼聚糖的摩爾比為1:0.8，反應(yīng)溫度為70℃，反應(yīng)時(shí)間為3h，研究不同作用功率對(duì)產(chǎn)物氨基取代度的影響，如圖6所示。

　　由圖6可以看出，在超聲波的條件下，產(chǎn)物氨基取代度隨著超聲波作用功率的增加不斷增大。當(dāng)超聲波作用功率為70W時(shí)，氨基取代度可達(dá)到82.5%。而在不使用超聲波的條件下，正常攪拌反應(yīng)3h后產(chǎn)物氨基的取代度僅為35.7%。這是因?yàn)殡S著超聲波作用功率的增加，超聲波能量增加，產(chǎn)生空化作用，提高非均相反應(yīng)的反應(yīng)速率加快反應(yīng)物和產(chǎn)物的擴(kuò)散，促進(jìn)固體羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿的生成。超聲波作用功率的增加，增加了熱效應(yīng)和空化效應(yīng)，從而使親核加成反應(yīng)的速率也隨之增加。當(dāng)超聲波功率超過70W之后，產(chǎn)物氨基取代度隨著超聲波作用功率的增加無明顯變化。因此確定超聲波的作用功率為70W。
　　2.3羧甲基殼聚糖席夫堿的抗菌性能
　　將羧甲基殼聚糖與羧甲基殼聚糖席夫堿分別配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的整理液。整理到棉織物上之后進(jìn)行抗菌，其對(duì)大腸埃希菌和金黃葡萄球菌的抑菌圈分別如下圖表示。
　　大腸埃希菌的抑菌作用如圖7所示：

　　金黃葡萄球菌的抑菌作用如圖8所示：

　　從圖7、圖8可以看出，羧甲基殼聚糖和羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿對(duì)大腸埃希菌和金黃葡萄球菌都有很好的抑菌效果，在整理后布樣的周圍都有抑菌圈，且圈中細(xì)菌不再生長。
　　表1為羧甲基殼聚糖與羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿對(duì)大腸埃希菌和金黃葡萄球菌抑菌測(cè)試結(jié)果的評(píng)價(jià)。

　　由表1可以看出，經(jīng)羧甲基殼聚糖與羧甲基殼聚糖席夫堿整理的棉織物試樣對(duì)大腸埃希菌和金黃葡萄球菌的抑菌效果都很好，抑菌帶均大于1mm，布樣下面均無細(xì)菌繁殖。根據(jù)GB/T20944.1-2007《紡織品抗菌性能的評(píng)價(jià)第1部分：瓊脂擴(kuò)散法》可知，當(dāng)抑菌帶大于1mm時(shí)表明有很好的抑菌效果，因此，羧甲基殼聚糖與羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿均有很好的抑菌性。通過對(duì)羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿與羧甲基殼聚糖的抑菌帶進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿對(duì)金黃葡萄球菌和大腸埃希菌的抑菌圈寬度分別比羧甲基殼聚糖的抑菌圈寬0.7mm和0.5mm，因此羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿有更好的抑菌效果。
　　3結(jié)論
　　1）以羧甲基殼聚糖和香草醛為原料制備羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿，在超聲波作用下，可明顯加快反應(yīng)速度，減少反應(yīng)時(shí)間，提高產(chǎn)物的氨基取代度，降低能耗，是一種快速、環(huán)保的制備羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿的方法。
　　2）在超聲波作用下，制備羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿的最佳工藝條件為：香草醛與羧甲基殼聚糖的反應(yīng)摩爾比為1:0.8，溫度為70℃，超聲波反應(yīng)時(shí)間3h，超聲波作用功率為70W。
　　3）羧甲基殼聚糖和羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿整理后純棉織物對(duì)金黃葡萄球菌和大腸埃希菌有很好的抗菌性，抑菌帶均大于1mm，且試樣下面無細(xì)菌的繁殖。羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿對(duì)金黃葡萄球菌和大腸埃希菌的抑菌帶寬度為2.1mm和1.7mm，分別比羧甲基殼聚糖的抑菌圈寬0.7mm和0.5mm，抑菌效果均高于羧甲基殼聚糖。